Diversitatea genotipică și rezistența la medicamente a tulpinilor de Mycobacterium tuberculosis: Teză de doctor în științe medicale: 313.02 – Microbiologie, virusologie medicală

Abstract

Structura tezei: introducere, patru capitole, concluzii generale și recomandări, bibliografie din 210 surse, două anexe, 15 tabele și 22 figuri. Rezultatele sunt publicate în 15 lucrări științifice. Cuvinte cheie: TB, M. tuberculosis complex, MDR, diagnostic de laborator, tratament antituberculos, secvențierea întregului genom, factori de risc, linii genotipice. Domeniul de studiu: 313.02 – Microbiologie, virusologie medicală. Scopul lucrării: De a studia diversitatea genotipică și caracteristicile molecular-genetice ale tulpinilor de Mycobacterium tuberculosis din Republica Moldova cu impact asupra fenomenului de rezistență. Obiectivele lucrării: 1. Aprecierea diversității genotipice și a evoluției temporale a tulpinilor multidrogrezistente de Mycobacterium tuberculosis în Republica Moldova. 2. Identificarea determinantelor genetice ale Mycobacterium tuberculosis cu rol putativ în răspândirea tulpinilor multidrog-rezistente în Republica Moldova. 3. Stabilirea potențialelor asocieri dintre determinantele genotipice cu impact asupra rezistenței la antimicrobiene a Mycobacterium tuberculosis și evoluția clinică a tuberculozei. 4. Identificarea corespondentelor genotipice ale rezistenței micobacteriene la medicamentele cheie utilizate în tratamentul tuberculozei multidrog-rezistente. Noutatea și originalitatea științifică: Rezultatele prezentului studiu descriu diversitatea genotipică a M. tuberculosis complex din Republica Moldova în baza analizei datelor de secvențiere a întregului genom micobacterian (Whole Genome Sequencing) obținute în baza unui lot de izolate micobacteriene selectate dintro perioadă de timp semnificativ mai lungă (6 ani) decât în studiile anterioare. Utilizând același set de date de secvențiere a fost analizat pentru prima dată un lot de izolate M. tuberculosis complex provenit din Europa de Est, a fost determinat rolul putativ al mutațiilor compensatorii și a unor mutații homoplazice în evoluția endemiei de TB MDR în această regiune. La fel, elementul novatoriu al lucrării este asigurat de evidențierea asocierilor dintre deficiențele de management clinic și apariția rezistenței la preparatele antituberculoase, la bolnavii TB, tratați în cadrul Programului național de răspuns la tuberculoză din Republica Moldova. Rezultatele noi pentru știință și practică: Majoritatea covârșitoare a tulpinilor MDR de M. tuberculosis complex circulante în Republica Moldova aparțin într-o proporție relativ stabilă (pe durata observată în studiu) liniilor genotipice L2 și L4, care manifestă diferențe semnificative în rezistența la medicamentele antituberculoase. Tulpinile MDR ale M. tuberculosis complex ce aparțin liniei genotipice L2, circulante în Republica Moldova, se caracterizează prin forme cu leziuni imagistice mai severe de tuberculoză pulmonară, fapt asociat cu prezența în genomul micobacterian a mutației Rv2828c T141R, fiind observată o selecție pozitivă pentru această mutație. Tulpinile MDR ale M. tuberculosis complex ce aparțin liniilor genotipice L4, circulante în Republica Moldova, se caracterizează printr-o rată deosebit de mare de transmitere în populație, unul dintre factorii potențiali asociați cu succesul epidemiologic al acestor tulpini fiind prezența mutațiilor compensatorii pentru rifampicină în gena rpoC a micobacteriei. În condițiile managementului programatic al bolnavilor de tuberculoză în Republica Moldova, rezistența tulpinilor de M. tuberculosis complex la medicamentele noi și repropuse precum bedaquilina și linezolidul este achiziționată secundar tratamentului TB MDR prin aplicarea unor scheme de tratament deficitare. Semnificația teoretică: Rezultatele acestei lucrări oferă argumentarea teoretică pentru succesul răspândirii liniilor filogenetice de M. tuberculosis complex L2 și L4 în Republica Moldova, în special identificând unele determinante genetice asociate cu selecția pozitivă a genotipurilor L2 precum și a altora care avantajează răspândirea genotipurilor L4. La fel, teza aduce ilustrarea teoretică a achiziționării rezistenței la medicamentele antituberculoase noi, secundar includerii acestora în scheme terapeutice deficitare utilizate la bolnavii de TB MDR. Valoarea aplicativă: Datele privitor la particularitățile corelației rezistenței geno-fenotipice și diferențele acestora dintre cele două genotipuri identificate (L2 și L4) în prezentul studiu își pot găsi aplicația în perfecționarea metodelor de testare a sensibilității la medicamente a tulpinilor M. tuberculosis complex, îmbunătățirii anchetării epidemiologice a focarelor de tuberculoză și identificarea măsurilor de reducere a riscurilor de achiziționare a rezistenței la medicamentele antituberculoase. Implementarea rezultatelor: Rezultatele tezei au fost implementate în cadrul Laboratorului Național de referință în Microbiologia Tuberculozei din cadrul Institutului de ftiziopneumologie ”Chiril Draganiuc”, fiind obținute două acte de implementare în procesul științifico-practic și două certificate de inovator.

Thesis structure: introduction, four chapters, general conclusions and recommendations, bibliography 210 sources, two annexes, 15 tables, and 22 figures. The results are published in 15 papers. Keywords: TB, M. tuberculosis, MDR, laboratory diagnostics, anti-tuberculosis treatment, whole genome sequencing, risk factors, genotypic lineages. Field of study: 313.02 – Microbiology, medical virology. Aim: To study the genotypic diversity and molecular-genetic characteristics of Mycobacterium tuberculosis strains from the Republic of Moldova with impact on mycobacterial drug resistance. Objectives: 1. To assess the genotypic diversity and temporal evolution of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis strains in the Republic of Moldova. 2. To identifying the genetic determinants of Mycobacterium tuberculosis potentially involved in the spread of multidrug-resistant strains in the Republic of Moldova. 3. To establish potential associations between genotypic determinants impacting the antimicrobial resistance of Mycobacterium tuberculosis and the clinical evolution of tuberculosis. 4. To identify genotypic correlates of mycobacterial resistance to key drugs used in the treatment of multidrug-resistant tuberculosis. Scientific novelty and originality: The results of the present study describe the genotypic diversity of M. tuberculosis complex in the Republic of Moldova based on the analysis of Whole Genome Sequencing data obtained from a set of mycobacterial isolates selected over a significantly longer period (6 years) than in previous studies. Additionally, for the first time on a set of M. tuberculosis complex isolates from Eastern Europe, the putative role of compensatory and homoplastic mutations in the evolution of the MDR-TB endemic in this region, was determined. Likewise, the work is ensured highlights the associations between clinical management deficiencies and the emergence of resistance to anti-tuberculosis drugs in TB patients treated under the National Tuberculosis Response Program in the Republic of Moldova. New results for science and practice: The overwhelming majority of MDR M. tuberculosis complex strains circulating in the Republic of Moldova belong in a relatively stable proportion (over the study period) to genotypic lineages L2 and L4, with significant differences in resistance to anti-tuberculosis drugs. MDR strains of M. tuberculosis complex belonging to genotypic lineage L2, circulating in the Republic of Moldova, are characterized by more severe radiographic lesions in pulmonary tuberculosis, a fact associated with Rv2828c T141R mutation in the mycobacterial genome, with positive selection observed for this mutation. MDR strains of M. tuberculosis complex belonging to genotypic lineage L4, circulating in the Republic of Moldova, are characterized by a particularly high rate of transmission in the population, one of the potential factors associated with the epidemiological success of these strains being the presence of compensatory mutations for rifampicin in the rpoC gene of the mycobacterium. Under the conditions of programmatic management of tuberculosis patients in the Republic of Moldova, resistance of M. tuberculosis complex strains to new and repurposed drugs such as bedaquiline and linezolid is acquired secondary to TB MDR treatment through the application of deficient treatment regimens. Theoretical significance: The results of this work provide putative theoretical explanation for the successful spread of phylogenetic lines of M. tuberculosis complex L2 and L4 in the Republic of Moldova, especially by identifying some genetic determinants associated with positive selection of L2 genotypes as well as others that potentially favor the spread of L4 genotypes. Likewise, the thesis provides theoretical illustration of the acquisition of resistance to new anti-tuberculosis drugs, secondary to their inclusion in deficient therapeutic MDR-TB treatment regimens. Applicative value: The data regarding the peculiarities of the correlation between geno-phenotypic resistance and their differences between the two identified genotypes (L2 and L4) in this study can be applied to improve methods for testing the susceptibility of M. tuberculosis complex strains to anti-tuberculosis drugs. Improving the epidemiological investigation of tuberculosis outbreaks and identifying measures to reduce the risks of acquiring resistance to anti-tuberculosis drugs. Implementation of results: The results of the thesis have been implemented at the National Reference Laboratory for Tuberculosis Microbiology at the Chiril Draganiuc Institute of Phthisiopneumology, resulting in two implementation and innovation certificates.

Структура диссертации: введение, четыре главы, общие выводы и рекомендации, библиография из 210 источников, два приложения, 15 таблиц и 22 рисунков. Результаты диссертации опубликованы в 15 работах. Ключевые слова: ТБ, M. tuberculosis, МЛУ, лабораторная диагностика, противотуберкулезное лечение, полногеномное секвенирование, факторы риска, генотипические линии. Область исследования: 313.02 – Микробиология, медицинская вирусология. Цель работы: Изучение генотипического разнообразия и молекулярно-генетических характеристик штаммов Mycobacterium tuberculosis в Республике Молдова, влияющих на лекарственную устойчивость. Задачи работы: 1. Оценка генетического разнообразия и временной эволюции штаммов Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью в Республике Молдова. 2. Идентификация генетических детерминант Mycobacterium tuberculosis, играющих роль в распространении штаммов с множественной лекарственной устойчивостью в Республике Молдова. 3. Установление потенциальных ассоциаций между генетическими детерми- нантами, влияющих на лекарственную устойчивость Mycobacterium tuberculosis, и клиническим течением туберкулеза. 4. Идентификация генетических изменении обусловливающих устойчивость Mycobacterium tuberculosis к ключевым препаратам, используемым в лечении туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью. Научная новизна и оригинальность: Результаты данного исследования описывают генотипическое разнообразие M. tuberculosis complex в Республике Молдова на основе анализа данных полногеномного секвенирования M. tuberculosis complex (Whole Genome Sequencing), полученных на основе выборки мико- бактериальных штамов, за значительно более длительного периода (6 лет) по сравнению с предыдущими исследованиями. Кроме того, впервые была определена потенциальная роль компенсаторных мутаций и гомоплазматических мутаций в эволюции эндемии МЛУ ТБ в этом регионе. Также инновационный элемент работы состоит в выявлении ассоциаций между отрицательными клиническими проявлениями туберкулеза и появлением устойчивости к противотуберкулезным препаратам у пациентов с ТБ, леченных в рамках Национальной Программы по Борьбе с Туберкулезом в Республике Молдова. Новые результаты для науки и практики: Подавляющее большинство МЛУ штаммов M. tuberculosis, цирку- лирующих в Республике Молдова, принадлежат к генотипических линиям L2 и L4, в относительно стабильном соотно- шении (на протяжении наблюдаемого периода в данном исследовании), которые характеризуются значительными различиями в резистентности к противотуберкулезным препаратам. МЛУ штаммы M. tuberculosis, принадлежащие генотипической линии L2, циркулирующие в Республике Молдова, характеризуются более тяжелыми радиологи- ческими поражениями легких, что связано с наличием мутации Rv2828c T141R в микобактериальном геноме, с наблю- дением положительной селекции для этой мутации. МЛУ штаммы M. tuberculosis, принадлежащие генотипической линии L4, циркулирующие в Республике Молдова, характеризуются особенно высокой степенью передачи в насе- лении, одним из потенциальных факторов, ассоциированных с эпидемиологическим успехом этих штаммов, является наличие компенсаторных мутаций для рифампицина в гене rpoC микобактерии. В условиях программного лечения больных туберкулезом в Республике Молдова резистентность штаммов M. tuberculosis complex к новым и препаратам, таким как бедаквилин и линезолид, приобретается вторично во время лечения МЛУ ТБ вследствие применения неполноценных схем лечения. Теоретическое значение: Результаты данной работы предоставляют аргументы, объясняющие успех распространения филогенетических линий L2 и L4 M. tuberculosis complex в Республике Молдова, в частности, были идентифицированы генетические особенности, ассоциированные с положительной селек- цией генотипов L2, а также те, которые способствуют распространению генотипов L4. Также диссертация дает теоретическое объяснение приобретению резистентности к новым противотуберкулезным препаратам, вторично использованию неполноценных терапевтических схем лечения, у больных с МЛУ ТБ. Прикладная ценность: Данные касающиеся корреляции гено-фенотипической устойчивости и их различиях между двумя выявленными генотипами (L2 и L4) полученные в данном исследовании могут быть применены для улучшения методов тестирования чувствительности штаммов M. tuberculosis complex к противотуберкулезным препаратам. Также представление данные могут быть применены для улучшения эпидемиологического исследования очагов туберкулеза и выявление мер по снижению рисков приобретения устойчивости к противотуберкулезным препаратам. Внедрение результатов: Результаты диссертации были внедрены в Национальной Лаборатории по Микробиологии Туберкулеза при Институте Фтизиопульмонологии им. Кирила Драганюка, в Кишиневе Республика Молдова. Также были получены два свидетельства о внедрении результатов диссертации в научно-практический процесс и два сертификата о инновации.