Combined grafts in the restoration of the articular cartilage experimental defect: Summary of Ph.D. thesis in medical sciences: 341.01 - Tissue engineering and cellular cultures

Abstract

The thesis is presented on 170 pages of typed electronic text and includes: introduction, 6 chapters, general conclusions and practical recommendations. Bibliographic index quotes 255 published articles. The thesis contains illustrative materials, represented in 12 tables and 59 figures. The results of the study are published in 62 scientific works. Key words: stem cells, chondrocytes, combined grafts, biphasic hierarchical grafts, osteochondral tissue, demineralization, decellularization, transplantation, hyaline cartilage, regeneration, cellular population. Aim of the study: restoration of experimental cartilage defect in the knee joint using combined osteochondral grafts obtained by tissue engineering. Objectives: development and optimization of methods necessary for isolation and cultivation of cells with chondroprogenitor potential from autologous tissues - hyaline cartilage and bone marrow; development of an osteochondral graft for regeneration of articular cartilage defects; transplantation of grafts combined with cells with chondroprogenitor potential in experimental defects; determination of the regeneration potential of experimental critical articular cartilage defects created at the load-bearing surface of the joint by using combined grafts, compared to the control group. The scientific novelty and originality: for the first time, several innovative techniques were developed and implemented, like processing methods and devices like the bone marrow sampling technique for isolation of stem cells for performing in vivo tests with autologous cells; stem cell cultivation procedure that allowed obtaining for transplantation a high purity stem cells culture; significant reduction of chondrocytes isolation period in large amounts with high viability, and development of a new way of cellular isolation using explants; development and testing of various types of osteochondral grafts obtained through tissue engineering techniques; development of a device for combining small-sized grafts with cells; establishing of the real amount and viability of cells at the time of transplantation; development of a histological score for objective evaluation of the regenerated cartilage; simplification of cells isolated cells identification through specific histochemical staining for the researched tissue. The important scientific problem solved in the thesis consists in elucidating the regeneration potential of combined grafts obtained from allogeneic osteochondral tissue processed by tissue engineering techniques and chondroprogenitor cells, and all the additional measures necessary to implement them. The theoretical importance: the research results will serve as scientific evidence in the process of obtaining and using combined grafts, consisting of autologous cells with chondroprogenitor potential - chondrocytes and mesenchymal stem cells from the bone marrow, with a graft obtained by demineralization and decellularization of allogeneic osteochondral tissue. The applicable value of the work: the experience gained in the process of obtaining cells with chondroprogenitor potential, of biphasic hierarchical grafts that have been tested in vitro, but also of grafts combined with their subsequent in vivo testing, can be used as basis for performing similar work in the laboratory, it can also be useful in guiding clinicians in the preparation and transplantation of similar grafts. Practical implementation: the obtained results of the experimental study are implemented in the Tissue Engineering and Cell Culture Laboratory, in the process of carrying out other doctoral theses, in the training process of students, residents and doctors at the Department of Anatomy and Clinical Anatomy, at the course of Regenerative medicine within SUMPh "Nicolae Testemițanu".

Lucrarea este expusă pe 170 pagini de text electronic și include: introducere, 6 capitole, concluzii generale și recomandări practice. Indicele bibliografic citează 255 surse literare. Materialul ilustrativ este reprezentat în 12 tabele și 59 figuri. Rezultatele obținute sunt publicate în 62 lucrări științifice. Cuvinte-cheie: celule stem, condrocite, grefe combinate, grefe ierarhic bifazice, țesut osteocondral, demineralizare, decelularizare, transplantare, cartilaj hialin, populare celulară. Scopul lucrării: Restabilirea defectului experimental de cartilaj în articulația genunchiului prin utilizarea grefelor osteocondrale combinate obținute prin inginerie tisulară. Obiectivele cercetării: elaborarea și optimizarea metodelor de izolare și cultivare a celulelor cu potențial condroprogenitor din ţesuturi autologe - cartilaj hialin și măduvă osoasă; conceperea unei grefe osteocondrale pentru recuperarea defectelor de cartilaj articular; transplantarea grefelor combinate cu celule cu potențial condroprogenitor în defectele experimentale; determinarea potențialului de regenerare a defectelor critice experimentale de cartilaj articular create la nivelul suprafeței portante a articulației prin utilizarea grefelor combinate, comparativ cu lotul martor. Noutatea și originalitatea cercetării: în premieră au fost elaborate și implementate în practica de laborator mai multe tehnici de lucru inovaționale, metode de procesare și dispozitive ca: tehnica de prelevare a măduvei osoase pentru izolarea de celule stem, pentru realizarea testelor in vivo cu celule autologe; metoda de cultivare a CSM, ce a permis obținerea în primul pasaj a unei culturi de CSM cu o puritate înaltă, pentru transplantare; reducerea semnificativă a duratei izolării unui număr mare de condrocite cu o viabilitate înaltă și elaborarea unei noi modalități de izolare a celulelor prin utilizarea de explante; elaborarea şi testarea a diverse tipuri de grefe osteocondrale obţinute prin tehnici de inginerie tisulară din ţesut alogen pentru combinare cu celule autologe; elaborarea și aplicarea unui dispozitiv pentru combinarea grefelor de dimensiuni mici cu celule; stabilirea cantității reale și viabilității celulelor la momentul transplantării; elaborarea unui scor histologic special pentru evaluarea obiectivă a rezultatelor obținute; simplificarea modalității de identificare a celulelor izolate prin colorarea histochimică specifică pentru țesutul cercetat. Problema științifică soluționată în teză: constă în elucidarea potențialului de regenerare a grefelor combinate obținute din țesut osteocondral alogen procesat prin tehnici de inginerie tisulară și celule condroprogenitoare, dar și toate măsurile suplimentare necesare pentru realizare. Semnificația teoretică: rezultatele cercetării vor servi drept dovezi științifice în procesul de obținere și utilizare a grefelor combinate, constituite din celule autologe cu potențial condroprogenitor – condrocite și celulele stem mezenchimale din măduva osoasă, cu o grefă obținută prin demineralizarea și decelularizarea țesutului osteocondral alogen. Valoarea aplicativă a lucrării: experiența dobândită în procesul obținerii de celule cu potențial condroprogenitor, de grefe ierarhic bifazice ce au fost testate in vitro, dar și a grefelor combinate cu ulterioara lor testare in vivo, este utilizată ca bază în executarea lucrărilor similare în cadrul laboratorului, de asemenea, poate fi utilă în ghidarea clinicienilor în pregătirea și transplantarea grefelor similare. Implementarea rezultatelor științifice: rezultatele studiului experimental obţinute sunt implementate în cadrul Laboratorului de Inginerie tisulară și culturi celulare, în procesul de efectuare a altor teze de doctorat, în procesul de instruire a studenţilor, rezidenţilor şi medicilor la Catedra de anatomie și anatomie clinică, la cursul de Medicină Regenerativă în cadrul USMF “Nicolae Testemițanu”.

Работа изложена на 170 страницах электронного текста и содержит: введение, 6 глав, общие выводы и практические рекомендации. Библиографический указатель ссылается на 255 литературных источника. Диссертация дополнена иллюстративным материалом в виде 12 таблиц и 59 графиков. Полученные результаты представлены в 62 научных публикациях. Ключевые слова: стволовые клетки, хондроциты, комбинированные трансплантаты, двухфазные иерархические трансплантаты, костно-хрящевая ткань, деминерализация, децеллюляризация, трансплантация, гиалиновый хрящ, тканеинженерный хрящ. Цель исследования: восстановление экспериментального дефекта хряща коленного сустава комбинированными костно-хрящевыми трансплантатами, полученными методом тканевой инженерии. Задачи исследования: разработка и оптимизация методов выделения и культивирования клеток с хондропрогениторным потенциалом; разработка костнохрящевого трансплантата; трансплантация комбинированных трансплантатов в экспериментальные дефекты; определение потенциала регенерации экспериментальных критических дефектов суставного хряща, с помощью комбинированных трансплантатов. Новизна и научная оригинальность: впервые были разработаны и внедрены в лабораторную практику инновации как новый метод забора костного мозга для выделения стволовых клеток и процедура их очищения от контаминационных клеток; значительно сократилось время выделения большого количества хондроцитов и разработан новый способ выделения клеток с использованием эксплантатов; разработка различных типов костно-хрящевых трансплантатов, полученных методами тканевой инженерии; разработка и применение устройства для целлюляризации малоразмерных трансплантатов; установление реального количества и жизнеспособности клеток на момент трансплантации; разработка гистологической шкалы для объективной оценки полученных результатов; упрощение идентификации изолированных клеток путем специфического гистохимического окрашивания исследуемой ткани в ёмкостях для культивацйи клеток. Научная задача, решаемая в диссертации: заключается в выявлении регенеративного потенциала комбинированных трансплантатов, полученных из аллогенной костно-хрящевой ткани, обработанной методами тканевой инженерии и хондропрогениторных клеток, а также всех дополнительных мероприятий, необходимых для их реализации. Теоретическая значимость: результаты исследований послужат научным доказательством в процессе получения и применения комбинированных трансплантатов клинических условиях. Прикладное значение работы: опыт полученный в процессе получения клеток с хондропрогениторным потенциалом, иерархических двухфазных трансплантатов, испытанных in vitro, но и комбинированых трансплантатов с их последующим тестированием in vivo, используется в качестве основы для выполнения аналогичной работы в лаборатории, а также может быть полезен в качестве руководствo для клиницистов при подготовке и трансплантации подобных трансплантатов. Внедрение результатов: полученные результаты внедряются в процессе выполнения других докторских диссертаций, в процес обучения студентов, ординаторов и врачей на кафедре анатомии и клинической анатомии, в курсе по Регенеративной медицины ГУМФ «Николае Тестемицану».