Morphological and biomechanical modifications in blood vessels decellularization: PhD thesis in medical sciences: 341.01 - Tissue engineering and cell cultures

Abstract

Structure of the thesis. The thesis includes annotations in Romanian, Russian and English, list of abbreviations, 48 figures, 6 tables, introduction, 4 chapters with general conclusions, practical recommendations, and study limitations. The paper is followed by the list of bibliographic references with 287 sources, author’s disclaimer, and author's CV. The principal results of the study were published in 20 scientific papers. Keywords: cardiovascular diseases, peripheral arterial disease, bypass surgery, vascular graft, tissue engineering, tissue engineered vascular graft, decellularization, detergent, enzymatic treatment, sonication. The aim of study. To develop new methods for decellularization of large- and small-diameter blood vessels. Objectives of the study. (1) To evaluate the efficiency of sonication-assisted methods for decellularization of arterial vessels; (2) To test the effect of acoustic amplitude on the vascular matrix; (3) To evaluate the effectiveness of chemical (SDS, SDC, Triton X-100, hypotonic solution) and enzymatic (DNase-I) treatment in vascular tissue decellularization; (4) To evaluate whether the decellularization protocol efficiency is depending on the vessel diameter; (5) To check the informativeness of qualitative methods (H&E and DAPI) for confirmation of the decellularization process; (6) To do morphological, biochemical, and biomechanical characterization of treated blood vessels; (7) To assess the biocompatibility of acellular scaffold by performing in vitro contact test; (8) To determine the efficiency of perfusion decellularization for uniform cells’ elimination from long segments of blood vessels. Scientific originality and novelty. Conducting the experimental study with comparison and multilateral characterization of decellularization efficiency of different decellularization approaches in term of cells’ elimination and matrix strength preservation contributed to the completion of some gaps in the current scientific literature. The scientific problem solved in the thesis consists in identifying the factors associated with efficient cells’ removal and establishing novel procedures for blood vessels decellularization and optimal characterization of acellular scaffold’s structure, a fact that will allow the modification of the experimental paradigm through the scientifically reasoned selection of the optimal experimental conditions. Theoretical significance and applicative value. Decellularization efficiency of different chemicals was specified; in addition, the indispensability of the enzymatic treatment in combination with strong detergents for accelular vascular scaffolds production was demonstrated. The data obtained during the research scientifically argue for the modification of the current research strategy through the preferential use of carotid artery vs aorta as testing model for development of small-diameter tissue-engineered vascular grafts. The failed attempt to use the ultrasound for vascular tissue DC defines the necessity to perform additional studies regarding the mechanism of ultrasound-induced cellular destruction. The practical impact of the present study consists in implementation of novel techniques of blood vessels decellularization in the Laboratory of Tissue Engineering and Cell Cultures, Nicolae Testemitanu State University of Medicine and Pharmacy of the Republic of Moldova.

Structura tezei. Teza include adnotările în limbile engleză, română și rusă, lista abrevierilor, 48 de figuri, 6 tabele, introducere, 4 capitole cu concluzii generale, recomandări practice și limitări ale studiului. Lucrarea este urmată de lista de referințe bibliografice cu 287 de surse, declarația autorului și CV-ul autorului. Principalele rezultate ale studiului au fost publicate în 20 de lucrări științifice. Cuvinte-cheie: boli cardiovasculare, boala arterială periferică, chirurgie bypass, grefă vasculară, inginerie tisulară, grefă vasculară obținută prin inginerie tisulară, decelularizare, detergent, tratament enzimatic, ultrasunet. Scopul studiului. Dezvoltarea unor tehnici noi de decelularizare a vaselor sanguine de calibru mare și mic. Obiectivele studiului. (1) Evaluarea eficienței metodelor asistate de sonicare în decelularizarea vaselor arterelor; (2) Testarea efectului amplitudinii acustice asupra matricei vasculare; (3) Determinarea eficacității tratamentului chimic (SDS, SDC, Triton X-100, soluție hipotonică) și enzimatic (DNază-I) în decelularizarea țesutului vascular; (4) Evaluarea eficienței protocolului de decelularizare în funcție de diametrul vasului; (5) Aprecierea informativității metodelor calitative (H&E și DAPI) pentru confirmarea procesului de decelularizare; (6) Caracterizarea morfologică, biochimică și biomecanică a vaselor sanguine prelucrate; (7) Testarea biocompatibilității matricei acelulare prin efectuarea testului de contact in vitro; (8) Determinarea eficienței decelularizării prin perfuzie pentru eliminarea uniformă a celulelor din segmentele lungi ale vaselor sanguine. Originalitatea și noutatea științifică. Realizarea studiului experimental cu compararea și caracterizarea multilaterală a eficienței diferitor tehnici de decelularizare în ceea ce privește eliminarea celulelor și păstrarea rezistenței matricei pentru completarea unor lacune din literatura științifică actuală. Problema științifică rezolvată în teză constă în: identificarea factorilor asociați cu îndepărtarea eficientă a celulelor din matrice și stabilirea unei proceduri noi de decelularizare a vaselor sanguine de calibru mic, și caracterizarea optimă a structurii acelulare, fapt care va permite modificarea paradigmei experimentale prin selectarea rațională din punct de vedere științific a condițiilor experimentale optime. Semnificația teoretică și valoarea aplicativă. A fost specificată eficiența de decelularizare a diferitor substanțe chimice; în plus, a fost demonstrat caracterul indispensabil al tratamentului enzimatic în combinație cu detergenți puternici pentru producerea matricei vasculare acelulare. Datele obținute argumentează științific modificarea strategiei actuale de cercetare prin utilizarea preferențială a arterei carotide față de aortă ca model de testare pentru dezvoltarea grefelor vasculare de diametru mic prin inginerie tisulară. Încercarea eșuată de a utiliza ultrasunetul pentru decelularizarea țesutului vascular definește necesitatea de a efectua studii suplimentare privind mecanismul de distrugere celulară indusă de undele sonore. Impactul practic al prezentului studiu constă în implementarea unei tehnici noi de decelularizare a vaselor sanguine în cadrul Laboratorului de inginerie tisulară și culturi celulare, Universitatea de Stat de Medicină și Farmacie „Nicolae Testemițanu”, Chișinău, Republica Moldova.

Структура диссертации. Диссертация включает аннотации на румынском, русском и английском языках, список сокращений, 48 рисунков, 6 таблиц, введение, 4 главы с общими выводами, практические рекомендации и ограничения исследования, список из 287 библиографических источников, авторскую декларацию и резюме. Основные результаты исследования опубликованы в 20 научных работах. Ключевые слова: сердечно-сосудистые заболевания, заболевания периферических артерий, шунтирование, сосудистый трансплантат, тканевая инженерия, сосудистый трансплантат полученный тканевой инженерией, децеллюляризация, детергент, ферментативная обработка, ультразвук. Цель исследования. Описать новые техники децеллюляризации кровеносных сосудов большого и малого калибра. Задачи исследования. (1) Оценить эффективность методов децеллюляризации сонной артерии свиньи с помощью ультразвука; (2) Проверить влияние акустической амплитуды на сосудистый матрикс; (3) Оценить эффективность химического (ДСН, ДДК, Тритон Х-100, гипотонический раствор) и ферментативного (ДНКаза-I) лечения при децеллюляризации сосудистой ткани; (4) Оценить эффективность протокола децеллюляризации в зависимости от диаметра сосуда; (5) Проверить информативность качественных методов (H&E и DAPI) для подтверждения процесса децеллюляризации; (6) Провести морфологическую, биохимическую и биомеханическую характеристику обработанных кровеносных сосудов; (7) Оценить биосовместимость бесклеточного каркаса путем проведения контактного теста in vitro; (8) Определить эффективность перфузионной децеллюляризации для однородного удаления клеток из длинных сегментов кровеносных сосудов. Научная оригинальность и новизна. Проведение экспериментального исследования со сравнением и многосторонней характеристикой эффективности различных методов децеллюляризации с точки зрения удаления клеток и сохранения прочности матрикса. Научная проблема, решаемая в диссертации, заключается в выявлении факторов, связанных с эффективным удалением клеток, и создании новой процедуры децеллюляризации кровеносных сосудов и оптимальной характеристики структуры ацеллюлярного матрикса, что позволит модифицировать экспериментальную парадигму путем научно обоснованного выбора оптимальных условий эксперимента. Теоретическая значимость и прикладное значение. Уточнена эффективность децеллюляризации различными химическими веществами; продемонстрирована незаменимость ферментативной обработки в сочетании с сильными детергентами для производства сосудистого ацеллюлярного матрикса. Неудачная попытка использования ультразвука определяет необходимость проведения дополнительных исследований относительно механизма разрушения клеток, индуцированного ультразвуком. Практическая значимость настоящего исследования заключается во внедрении новой методики децеллюляризации кровеносных сосудов в Лаборатории тканевой инженерии и культуры клеток Государственного Университета Медицины и Фармации им. Николае Тестемицану, Кишинев, Республика Молдова.