Preparation of vascularized bone allografts – experimental study: Summary of PhD thesis in medical sciences: 321.18 Orthopedics and traumatology

Abstract

Thesis structure: the thesis is presented over 143 pages and includes: table of contents, list of abbreviations, 13 tables, 45 figures, introduction, 4 chapters, general conclusions, and practical recommendations. The work concludes with a reference list composed of 257 titles, 2 appendices, the author’s CV, and a declaration of responsibility. The results of the study have been published in 18 scientific papers. Keywords: bone allograft, composite allograft, vascularized allograft, decellularization, tissue engineering, extracellular matrix, recellularization, biocompatibility. Study Objective: to develop a universal decellularization protocol for tissues with varying degrees of mineralization for the purpose of obtaining vascularized composite bone grafts with minimal immunogenic qualities. Study objectives: (1) To develop a surgical technique for obtaining vascularized bone grafts from tibial bone in laboratory animals; (2) To establish a decellularization protocol for bone grafts (tibial bone) while preserving the vascularization pedicle; (3) To test the effectiveness of the bone graft decellularization method using qualitative (H&E, DAPI, SEM) and quantitative (DNA quantification) techniques; (4) To test the biocompatibility of vascularized extracellular bone matrix through in vitro recellularization using different cell types. Scientific novelty and originality: a universal decellularization protocol for composite bone grafts (hard tissue + soft tissue) was developed and tested. In vitro recellularization of vascular extracellular matrix, avascular bone extracellular matrix, and vascularized extracellular bone matrix was achieved using various cell types. Scientific problem addressed in the thesis: the most important aspects of decellularization of soft and hard tissues were determined and characterized based on the same decellularization protocol. Subsequent in vitro recellularization of the obtained extracellular matrices was successfully achieved. Theoretical significance of the thesis: drawing up a universal decellularization protocol for composite bone grafts, and the results collected following this study can be a useful scientific basis for subsequent in vivo studies. Applicative value of the thesis: this study represents an important step in supporting future preclinical in vivo studies aimed at developing a new surgical method for treating massive bone defects of various origins in the locomotor system, through the use of vascularized decellularized bone allografts obtained via tissue engineering. Implementation of scientific results: the results obtained have been used in another experimental in vivo study titled ,,Treatment of large bone defects using a decellularized vascularized bone allograft incorporated into the recipient's vascular circuit”. Thus, we anticipate implementing a new decellularization protocol for vascularized composite bone grafts within the Tissue Engineering and Cell Cultures Laboratory at SUMF ,,Nicolae Testemitanu”.

Structura tezei: lucrarea este expusă pe 143 pagini şi include: cuprins, lista abrevierilor, 13 tabele, 45 de figuri, introducere, 4 capitole, concluzii generale şi recomandări practice. Lucrarea se finisează cu lista de referinţe alcătuită din 257 titluri, 2 anexe, CV-ul autorului și declaraţia autorului privind asumarea răspunderii. Rezultatele studiului au fost publicate în 18 lucrări ştiinţifice. Cuvintele-cheie: alogrefă osoasă, alogrefă compozită, alogrefă vascularizată, decelularizare, inginerie tisulară, matrice extracelulară, recelularizare, biocompatibilitate. Scopul studiului: Elaborarea protocolului universal de decelularizare a ţesuturilor cu divers grad de mineralizare în scopul obţinerii grefelor osoase compozite vascularizate cu calităţi imunogene minime. Obiectivele studiului: (1) Elaborarea eseului chirurgical pentru obținerea grefei osoase vascularizate a osului tibial la animale de laborator; (2) Elaborarea protocolului de decelularizare a grefelor osoase (os tibial) cu păstrarea sursei de vascularizare; (3) Testarea eficacității metodei de decelularizare a grefelor osoase prin metode calitative (H&E, DAPI, SEM) şi cantitative (cuantificarea ADN-ului); (4) Determinarea biocompatibilităţii matricelor extracelulare osoase vascularizate prin recelularizarea in vitro utilizând diferite tipuri de celule. Noutatea şi originalitatea ştiinţifică: am elaborat şi testat un protocol universal de decelularizare pentru grefele osoase compozite (ţesut dur + ţesut moale). S-a obţinut recelularizare in vitro a MEC vasculare, MEC osoase avasculare și a MEC osoase vascularizate utilizând diferite tipuri de celule. Problema ştiinţifică rezolvată în teză: am determinat și caracterizat cele mai importante aspecte ale decelularizării țesuturilor moi și dure pe baza aceluiași protocol de decelularizare. Am reuşint ulteriora recelularizarea in vitro a matricelor extracelulare obţinute. Semnificaţia teoretică: am elaborat un protocol universal de decelularizare pentru grefele osoase compozite (țesut moale + țesut dur), iar rezultatele colectate în urma acetui studiu pot servi o bază ştiinţifică utilă pentru ulterioarele studii in vivo. Valoarea aplicativă a lucrării: studiul dat reprezintă un pas important în susţinerea viitoarelor studii preclinice in vivo pentru elaborarea unei noi metode chirurgicale în tratamentul defectelor osoase masive de diferită geneză la nivelul aparatului locomotor, prin utilizarea alogrefelor osoase decelularizate vascularizate obținute prin inginerie tisulară. Implementarea rezultatelor ştiinţifice: rezultatele obţinute au fost utilizate în cadrul altui studiu experimental in vivo – ,,Plastia defectelor osoase vaste prin allogrefaj osos vascularizat decelularizat inclus în circuitul vascular adoptiv”. Astfel, preconizăm implementarea în cadrul Laboratorului de Inginerie tisulară și culturi celulare a USMF „Nicolae Testemiţanu”, a unui nou protocol de decelularizare pentru grefele osoase compozite vascularizate.

Структура диссертации: диссертация представлена на 143 страницах и включает: содержание, список сокращений, 13 таблиц, 45 рисунков, введение, 4 главы, общие выводы и практические рекомендации. Диссертация завершается списком литературы, состоящим из 257 наименований, 2 приложениями, резюме автора и заявлением автора о принятии ответственности. Результаты исследования были опубликованы в 18 научных работах. Ключевые слова: костный аллотрансплантат, композитный аллотрансплантат, васкуляризованный аллотрансплантат, деклеткация, тканевая инженерия, внеклеточный матрикс, реклеткация, биосовместимость. Цель исследования: pазработка универсального протокола децеллюляризации тканей с различной степенью минерализации с целью получения васкуляризованных композитных костных трансплантатов с минимальными иммуногенными качествами. Задачи исследования: (1) Разработка хирургической техники для получения васкуляризованных костных трансплантатов из тибиальной кости у лабораторных животных; (2) Установление протокола децеллюляризации костных трансплантатов (тибиальная кость) с сохранением источника васкуляризации; (3) Проверка эффективности метода децеллюляризации костных трансплантатов с использованием качественных и количественных методов; (4) Определение биосовместимости внеклеточных матриц костей с васкуляризацией через реклеткацию in vitro с использованием различных типов клеток. Научная новизна и оригинальность: pазработан и протестирован универсальный протокол децеллюляризации для композитных костных трансплантатов (твердая ткань + мягкая ткань). Достигнута pецеллюляризация in vitro сосудистого внеклеточного матрикса, авascular костных матриц и васкуляризованных костных матриц с использованием различных типов клеток. Научная проблема, решенная в диссертации: oпределены и охарактеризованы наиболее важные аспекты децеллюляризации мягких и твердых тканей на основе одного и того же протокола децеллюляризации. Успешно осуществлена последующая pецеллюляризация in vitro полученных внеклеточных матриц. Теоретическая значимость: pазработан универсальный протокол децеллюляризации для композитных костных aллoтрансплантатов (мягкая ткань + твердая ткань), а собранные результаты данного исследования могут служить полезной научной основой для будущих in vivo исследований. Прикладная ценность работы: данное исследование представляет собой важный шаг в поддержке будущих доклинических исследований in vivo для разработки нового хирургического метода лечения массивных костных дефектов различного происхождения в опорно-двигательном аппарате с использованием васкуляризованных децеллюляризации костных аллотрансплантатов, полученных с помощью тканевой инженерии. Внедрение научных результатов: полученные результаты уже использованы в другом in vivo исследовании – ,,Пластика обширных костных дефектов децеллюляризированным васкуляризированным костным аллотрансплантатом, включенным в адоптивный крoвoтoк”. Таким образом, планируицa внедрение нового протокола децеллюляризации васкуляризированных композитных костных aллoтрансплантатов в рамках Лаборатории тканевой инженерии и клеточных культур Государственного Медицинского и Фармацевтического Университета им. Николае Тестемицану.