Beta-lactam resistance of gram-negative bacilli isolated from clinical biosubstrates: Summary of the thesis of doctor in medical sciences: 313.02 – Microbiology, medical virology

Abstract

Relevance of the research Antimicrobial resistance (AMR) has emerged as one of the most critical global public health threats of the 21st century. Beyond its devastating impact on health, AMR places a significant social and economic burden on healthcare systems, driving up medical costs and contributing to treatment failures, which can sometimes be fatal [1,2,3,4,5]. In this context, Gram-negative bacilli are of particular concern due to their significant ability to rapidly develop and spread multiple resistance mechanisms [6]. The situation is especially alarming in infections caused by multidrug-resistant (MDR), extensively drug-resistant (XDR), and pandrug-resistant (PDR) bacteria, for which therapeutic options are extremely limited or, in some cases, completely unavailable [7.8]. Their high capacity to adapt to antibiotic pressure makes these pathogens a major challenge in medical practice, particularly in the context of healthcare-associated infections [6,9,10]. The relevance of this topic is strongly supported by recent reports from the World Health Organization (WHO), the Centers for Disease Control and Prevention (CDC) [11,12,13], and the European Centre for Disease Prevention and Control (ECDC) [14,15]. These reports classify carbapenem- and third-generation cephalosporin-resistant Gram-negative bacilli — including Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Acinetobacter baumannii, and Pseudomonas aeruginosa — as a critical priority for the development of new antibiotics. Furthermore, they highlight that 10 out of the 18 major health threats associated with antibiotic-resistant microorganisms are caused by Gram-negative bacilli [16,17,18]. Non-fermenting Gram-negative bacilli are among the main causes of invasive infections, accounting for up to 75% of cases, including both healthcare-associated and community-acquired infections. Alarmingly, these pathogens are also responsible for up to 42% of infection-related deaths [6,11]. In the Republic of Moldova, as in many other resource-limited countries, the problem is further worsened by the irrational and excessive use of antimicrobial agents, the lack of comprehensive antimicrobial stewardship programmes, and insufficient microbiological surveillance capacity [19]. Local studies reveal a worrying trend of increasing prevalence of extended-spectrum β-lactamase (ESBL)-producing Enterobacterales and carbapenem-resistant strains. Among the priority pathogens identified are carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae (KPC), metallo-β-lactamase (MBL) and oxacillinase (OXA) producers, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, and third-generation cephalosporin-resistant Gram-negative bacilli, including ESBL-producing Escherichia coli [19,20,21]. At present, the capacity of microbiology laboratories in the country to detect ESBLs and carbapenemases remains limited. This is largely due to the wide variety of these enzymes and the absence of a clearly defined diagnostic algorithm. As a result, some mechanisms contributing to the development of AMR cannot be fully identified, increasing the risk of underdiagnosis [21,22,23]. This situation turns AMR from a theoretical threat into a pressing clinical and epidemiological reality. Patients with infections caused by resistant Gram-negative bacilli undergo longer hospital stays, require more expensive treatments, and experience significantly higher mortality rates. At the same time, healthcare systems come under growing pressure, and the risk of returning to a so-called “post-antibiotic era,” where common infections may once again become life-threatening, is becoming increasingly real [16,24,25]. Therefore, an in-depth investigation of antimicrobial resistance in Gram-negative bacilli is highly relevant today, highlighting the need to develop a standardized algorithm for detecting resistance mechanisms, as well as effective national policies for surveillance, prevention, and control. These measures should be aligned with the principles of the “One Health” approach and international recommendations. High-quality research, data, and analysis are essential for developing new measures to combat AMR and for supporting policymakers in improving actions in this area. The research purpose was to assess resistance profiles to β-lactams and determine the phylogenetic groups of priority GNB, with the development of a standardized methodological algorithm for detecting resistance mechanisms, and to propose effective measures for the prevention and control of antimicrobial resistance. Research objectives are as following: to determine the antimicrobial resistance profiles of GNB isolated from various clinical biosubstrates; to perform molecular description of extended-spectrum beta-lactamases (ESBLs) and carbapenemases associated with GNB; to conduct a comparative analysis of different microbiological techniques for identifying beta-lactam-resistant GNB, with the development of a standardized methodological algorithm; and to propose effective measures for the prevention and control of infections caused by multidrug-resistant GNB. Research hypothesis. The microbiological and epidemiological characteristics of antimicrobial resistance in GNB, shaped by the variability of resistance mechanisms and the effectiveness of surveillance and control strategies, play a main role in reducing the socioeconomic burden of infections caused by resistant bacteria and in strengthening efforts to combat AMR. Scientific novelty and originality of the results. In the Republic of Moldova, a comprehensive study of priority Gram-negative bacteria was conducted using contemporary phenotypic methods and molecular biology techniques, which enabled the identification and characterization of resistance patterns and the detection of the main resistance mechanisms of these pathogens, as well as the assessment of the position of these Gram-negative bacteria within global phylogenetic trees. These data are extremely important for forecasting the evolution of resistance of these organisms at the regional level. The study results served as the basis for developing a standardized algorithm for detecting antimicrobial resistance mechanisms, which will be implemented in microbiology laboratories within the national AMR surveillance network. Findings that contributed to solving the scientific problem. This study identified the microbiological range of priority GNB, as well as the genotypic and phenotypic diversity of antimicrobial-resistant strains, including: the prevalence of ESBL- and carbapenemase-producing GNB strains in Moldova; the range of resistance enzymes in GNB; the predominant sequence type among circulating GNB strains in the country. A standardized algorithm for detecting antimicrobial resistance markers was developed, along with evidence-based recommendations for improving AMR surveillance and control. Practical implementation of the results. Based on the research findings, a standardized algorithm for detecting antimicrobial resistance mechanisms in priority GNB was developed and scientifically justified. To improve the quality of microbiological investigations, two practical guides were developed for medical personnel involved in the collection, transport, and processing of blood, cerebrospinal fluid (CSF), and urine samples for bacteriological testing. Within the study, the guide “Detection of Antimicrobial Resistance Mechanisms, Interpretation and Clinical Application of the Results” was developed and approved by Order No. 1239 of 29.12.2023, as well as the methodological instruction “Detection of Antimicrobial Resistance Mechanisms”, approved at the meeting of the Quality Management Council of ‘Nicolae Testemițanu’ State University of Medicine and Pharmacy, minutes No. 2 of 29.11.2023. These educational materials were incorporated into the study programs for lectures and practical sessions for students, residents, and physicians, and were implemented in practice in the laboratories of public health centers. The brochure “Method for raising awareness in children about the prevention of antimicrobial resistance”, developed during the study, is a valuable resource for introducing children to the world of microorganisms — both friendly and harmful — as well as to protective measures aimed at preventing infections caused by pathogenic microbes (Annex 7). This work was presented at the International Exhibition of Innovation and Technology Transfer EXCELLENT IDEA – 2023, 2nd Edition, Chișinău, under the title “Method for Raising the Degree of Awareness in Children About the Prevention of Antimicrobial Resistance”, where it was awarded a silver medal. The leaflets, posters, and interactive games developed based on this brochure were presented at the event “European Researchers' Night”. Research results approval. The research methodology and study design were reviewed and approved during the meeting of the Research Ethics Committee of Nicolae Testemițanu USMF, with a favourable opinion issued for the doctoral research project titled “Beta-lactam Resistance in Gram-Negative Bacilli Isolated from Clinical Biosubstrates”, meeting minutes No. 1 of January 10, 2022. The thesis topic was discussed and approved within the primary unit at the joint meeting of the doctoral leadership, the members of the supervisory committee, and the staff of the Scientific Laboratory for Antimicrobial Resistance Surveillance, the Microbiology Laboratory, and the Department of Epidemiological Surveillance of Healthcare-Associated Infections and Antimicrobial Resistance (excerpt from the minutes No. 1 of the joint meeting of 11.02.2022), as well as at the specialized Scientific Seminar 313: Immunology, Microbiology, Virology, specialties 321.09 Infectious, Tropical and Parasitic Diseases, and 313.02 Medical Microbiology, Medical Virology (excerpt from the minutes No. 1 of 27.01.2023) The PhD thesis results. The research findings are summarised in 28 scientific publications, including four as first author and two as sole author. These comprise: four articles published in SCOPUS-indexed journals, six articles in national scientific journals, one article in an international journal, two abstracts presented at international scientific forums, eight abstracts at national forums, one guide, one methodological guideline, and one educational brochure. The results were also shared through eight active presentations at scientific events. As part of this work, four innovation certificates were obtained. PhD thesis volume and structure. The thesis is presented across 65 pages of core text and includes the following sections: title page, table of contents, lists of abbreviations, tables, and figures, introduction, four chapters, general conclusions, recommendations, 165 bibliographic references, and ninet annexes. The visual material comprises 14 tables and 31 figures.

Actualitatea temei Rezistența la antimicrobiene (RAM) a devenit una dintre cele mai presante provocări globale ale sănătății publice în secolul XXI. Devenind o povară atât socială, cât și economică gravă, RAM generează costuri ridicate de asistenţă medicală, precum și erori de tratament, soldate uneori cu deces [1,2,3,4,5]. În acest context, bacilii Gram-negativi ocupă un loc central în problematica RAM, datorită capacității lor ridicate de a dezvolta și disemina rapid mecanisme multiple de rezistență [6]. Situația este deosebit de alarmantă în cazul infecțiilor cauzate de bacterii multirezistente (MDR), extensiv rezistente (XDR) și panrezistente (PDR), pentru care opțiunile terapeutice sunt extrem de limitate sau inexistente [7,8]. Această capacitate ridicată de adaptare la acțiunea antibiotică îi transformă în agenți patogeni extrem de problematici în practica medicală, mai ales în infecțiile associate asistenței medicale [6,9,10]. Actualitatea acestui subiect este evidențiată de rapoartele recente ale Organizației Mondiale a Sănătății (OMS) [11,12,13], Centrul pentru Prevenirea și Controlul Bolilor (CDC) și ale Centrului European pentru Prevenirea și Controlul Bolilor (ECDC) [14,15], care clasifică bacilii Gram-negativi rezistenți la carbapeneme și cefalosporine de generația a treia (Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa) drept prioritate critică pentru dezvoltarea de noi antibiotice și constată că zece din cele 18 amenințări la adresa sănătății legate de microorganisme rezistente la antibiotice sunt reprezentate de BGN [16,17,18]. Bacilii gramnegativi nefermentativi se evidențiază printre agenții cauzali ai infecțiilor invazive, fiind responsabili de până la 75 % din cazurile de infecții, inclusiv infecții asociate asistenţei medicale (IAAM) și infecții comunitare, și până la 42 % din cazurile de deces [6,11]. În Republica Moldova, ca și în multe alte țări cu resurse limitate, problema este amplificată de utilizarea irațională și abuzivă a preparatelor antimicrobiene, lipsa programelor susținute de stewardship antimicrobian și capacitatea insuficientă de supraveghere microbiologică [19]. Studiile locale indică o tendință îngrijorătoare de creștere a tulpinilor de Enterobacterales producătoare de β-lactamaze cu spectru extins (BLSE) și a tulpinilor rezistente la carbapeneme, pe lista prioritară aflându-se: Klebsiella pneumoniae, producătoare de carbapenemaze (KPC), metalo-β-lactamaze (MBL) și oxacilinaze (OXA), Pseudomonas aeruginosa și Acinetobacter baumannii, precum și BGN rezistenți la cefalosporinele de generația a III-a (CG3), inclusiv Escherichia coli producătoare de BLSE [19,20,21]. Actualmente, posibilitățile laboratoarelor microbiologice din țară de detectare a BLSE și a carbapenemazelor sunt limitate din cauza spectrului variat al acestor enzime și a lipsei unui algoritm bine definit de cercetare. În acest context, unele dintre mecanismele de dezvoltare a RAM nu pot fi pe deplin elucidate, persistând riscul de subdiagnosticare [21,22,23]. Această situație transformă RAM dintr-o amenințare teoretică într-o realitate clinică și epidemiologică: pacienții cu infecții cauzate de bacili Gram-negativi rezistenți au spitalizări mai lungi, necesită tratamente mai costisitoare, iar mortalitatea asociată este semnificativ mai mare. În același timp, crește presiunea asupra sistemelor de sănătate, iar riscul de întoarcere la o „eră post-antibiotică”, în care infecții banale pot deveni letale, este din ce în ce mai real [16,24,25]. Prin urmare, studierea aprofundată a rezistenței bacililor Gram-negativi la antimicrobiene este de maximă actualitate, justificând necesitatea elaborării unui algoritm standardizat de detectare a amecanismelor de rezistență, precum a politicilor naționale eficiente de supraveghere, prevenire și control, în concordanță cu principiile conceptului „One Health” și recomandările internaționale. Cercetările, datele și analizele de înaltă calitate sunt esențiale ca bază pentru elaborarea de măsuri noi pentru combaterea RAM și pentru a ajuta factorii de decizie să perfecționeze activitatea în acest domeniu. Scopul cercetării: evaluarea profilurilor de rezistență la β-lactamine și stabilirea grupurilor filogenetice ale BGN prioritari cu elaborarea algoritmului metodologic standardizat de detectare a mecanismelor de rezistență și propunerea de măsuri eficiente de prevenire și control a rezistenței la antimicrobiene. Obiectivele cercetării: determinarea profilurilor de rezistență la antimicrobiene ale BGN izolați din diferite biosubstraturi clinice; caracterizarea moleculară a beta-lactamazelor cu spectru extins (BLSE) și a carbapenemazelor aferente BGN; analiza comparativă a diferitor tehnici microbiologice de identificare a BGN rezistenți la beta-lactamine cu dezvoltarea unui algoritm metodologic standardizat; propunerea de măsuri eficiente de prevenire și control a infecțiilor cauzate de BGN multirezistenți. Ipoteza cercetării Particularitățile microbiologice și epidemiologice ale rezistenței BGN la antimicrobiene, influențate de variabilitatea mecanismelor de rezistență, precum și de eficiența supravegherii și controlului răspândirii acestor microorganisme, contribuie la reducerea impactului socioeconomic al infecțiilor determinate de bacteriile rezistente și la consolidarea măsurilor de combatere a fenomenului de RAM. Noutatea şi originalitatea ştiinţifică a rezultatelor obținute: în Republica Moldova a fost realizat un studiu complex al BGN prioritari cu utilizarea metodelor fenotipice contemporane și a tehnicilor de biologie moleculară, ceea ce a permis identificarea și stabilirea pattern-urilor de rezistență cu detectarea principalelor mecanisme de rezistență ale acestor patogeni, precum şi evaluarea poziţiei BGN în arborii filogenetici globali. Aceste date sunt extrem de importante pentru prognozarea evoluției rezistenței acestor germeni la nivel regional. Rezultatele studiului au servit drept bază pentru elaborarea unui algoritm standardizat de detectare a mecanismelor de rezistență la antimicrobiene, care va fi implementat în laboratoarele microbiologice din cadrul retelei naționale de supraveghere a RAM. Rezultatele obținute care au contribuit la soluționarea problemei științifice. În cadrul acestei cercetări a fost identificat spectrul microbiologic al BGN prioritari, diversitatea genotipică și fenotipică a tulpinilor rezistențe la antimicrobiene, inclusiv: prevalența tulpinilor de BGN producătoare de BLSE și de carbapenemaze în RM; spectrul de enzime de rezistență la BGN; tipul de secvență predominant la tulpinile de BGN circulante pe teritoriul țării. A fost elaborat un algoritm standardizat de determinare a markerilor rezistenței la antimicrobiene și propuse de măsuri îmbunătățite de supraveghere și control al RAM bazate pe dovezi. Implementarea practică a rezultatelor. În baza rezultatelor cercetărilor efectuate a fost argumentat și elaborat algoritmul de determinare a mecanismelor de rezistență la antimicrobiene ale BGN prioritari. Pentru îmbunătățirea calității investigațiilor microbiologice au fost elaborate două ghiduri pentru personalul medical implicat în procesul de colectare, de transportare și de procesare a probelor de sânge, de lichid cefalorahidian (LCR) și de urină pentru investigații bacteriologice. În cadrul studiului a fost elaborat ghidul: „Detectarea mecanismelor de rezistență la antimicrobiene, interpretarea și aplicarea clinică a rezultatelor”, aprobat prin Ordin nr.1239 din 29.12.2023; și indicația metodică „Detectarea mecanismelor de rezistență la antimicrobiene” aprobată la ședința Consiliului de management al calității al USMF „Nicolae Testemițanu”, proces-verbal, nr.2 din 29.11.2023. Aceste materiale didactice au fost incluse în programele de studii pentru prelegeri şi lucrări practice pentru studenţi, rezidenţi şi medici și implementate în practică în laboratoarele centrelor de sănătate publică. Broșura „Metodă de creștere a gradului de conștientizare la copii cu privire la prevenirea rezistenței la antimicrobiene” elaborată în timpului studiului va fi de un real folos pentru familiarizarea copiilor cu lumea microorganismelor, cu cele prietenoase și neprietenoase, precum și cu măsurile de protecție pentru evitarea infecțiilor cu microorganisme patogene (anexa 7). Această lucrare a fost expusă la International exhibition of innovation and technology transfer EXCELLENT IDEA – 2023, 2nd edition, Chisinau - „Method for raising the degree of awareness in children about the prevention of antimicrobial resistance”, unde a fost apreciată cu medalie de argint. Bucletele, pliantele, posterele și jocurile interactive întocmite pe baza acestei broșuri au fost expuse la „Noaptea tinerilor cercetători”. Aprobarea rezultatelor Metodologia de cercetare și designul studiului au fost evaluate și aprobate la ședința Comitetului de etică a cercetării al USMF „Nicolae Testemițanu”, fiind eliberat aviz favorabil la proiectul științific de doctorat cu titlul „Rezistența la beta-lactamine a bacililor gramnegativi izolați din biosubstraturi clinice ", proces-verbal nr. 1 din 10.01.2022. Tema tezei a fost discutată și aprobată în cadrul unității primare la ședința comună a conducăturului de doctorat, membrii comisiei de indrumare și colaboratorii Laboratorului științific Supravegherea rezistenței la Antimicrobiene, Laboratorul microbiologic și Secția Supravegherea epidemiologică a infecțiilor associate asistenței medicaleși rezistență antimicrobiană (extras din process verbal nr. 1 al ședinței comune din 11.02.2022), precum și la Seminarul științific de profil 313. Imunologie, microbiologie, virusologie, specialitățile 321.09. Boli infecțioase, tropicale și parazitologie medicală 313.02. Microbiologie, virusologie medicală (extras din process verbal nr. 1, din 27.01.2023). Prezentarea rezultatelor cercetării Rezultatele cercetărilor sunt reflectate în 28 de lucrări ştiinţifice (patru – ca prim autor, două - monoautor), inclusiv: patru articole în reviste indexate în baza de date SCOPUS, șase articole în reviste ştiinţifice naţionale, un articol în reviste editate în străinătate, două teze la foruri științifice internaționale, opt teze la foruri științifice naţionale, un ghid, o indicație metodică, o broșură. Rezultatele cercetărilor au fost diseminte și prin opt participări active la foruri științifice. În urma cercetărilor efectuate, au fost obținute patru certificate de inovator. Volumul și structura tezei Teza este expusă pe 65 pagini de text de bază și include următoarele compartimente: foaie de titlu, cuprins, lista abrevierilor, a tabelelor și a figurilor, introducere, patru capitole, concluzii generale, recomandări, 165 de referințe bibliografice și 9 anexe. Materialul iconografic cuprinde 14 tabele și 31 de figuri.