Suport celular pentru ingineria tisulară

Abstract

Scop. Obținerea unui suport tridimensional hibrid din colagen tip I și chitosan pentru fixarea celulelor cultivate in vitro, favorizarea adeziunii celulare și proliferării acestora. Material și metode. Materiale utilizate pentru obținerea spongiei hibride colagen/chitosan au fost tendoane de bovină care după mărunțire au fost prelucrate cu soluție de 0,05M de Na2HPO4 timp de 4 zile, după care s-a supus procesului de digestie enzimatică cu pepsină în cantitate de 100 mg/gram tendon cu acid acetic EDTA timp de 24 de ore la 4°C. Apoi colagenul obținut se purifică prin precipitarea cu 1,8M NaCl, după care se dizolvă cu acid acetic și se dializează în săculețe cu dimensiunile porilor de 12000 Da (Sigma) într-un volum mare de soluție de 0,02M Na2HPO4 pînă pH-ul soluției de colagen devine neutru sau slab bazic, apoi acesta se îngheață la -60°C și se lasă la dezghețat la temperatura camerei. Colagenul se separă de restul lichidului prin centrifugare la 1000 g timp de 10 min. Colagenul obținut se dizolvă cu acid acetic pînă la concentrația de 1%, apoi se liofilizează (EVD-12; Unicryo MCL-60). Spongia obținută se tratează timp de 24 de ore cu soluție chitosan de 0,25%. Apoi se spală cu apă distilată pe vibrator (Leleux, Laborwelt, V7032) cu schimbarea apei. După care spongia cu chitosan se usucă prin liofilizare și ulterior reticulează la temperatura camerei în aburi de glutaraldehidă de 12,5% (SERVA) timp de 24 ore. Rezultate. Dimensiunile porilor în cazul spongiei colagenice variază între 50 și 200μ, iar în cazul spongiilor hibride dimensiunile porilor variază între 30 și 100μ. Concluzii. Tehnică de obținere a matricei hibride din colagen este una efectivă. Structura microscopică și dimensiunile spongiei permit de a fi utilizată pentru suplinirea unor defecte de țesuturi, cît și utilizarea pentru ingineria tisulară.

Purpose. To obtain a three-dimensional collagen type I/chitosan scaffold for seeding the cells cultured in vitro, and promotion of cell adhesion and proliferation. Materials and methods. Materials used to obtain a collagen I/chitosan hybrid scaffold were bovine tendons that after mincing have been processed with 0,05M Na2HPO4 solution for 4 days, followed by enzymatic digestion with pepsin 100 mg per 1gr. of tendon, EDTA and acetic acid for 24 hours at 4°C. Then collagen was purified by precipitation with 1.8 M NaCl, followed by acetic acid dissolution and dialysis in bags with 12000 Da pore size by a large volume of 0.02 M Na2HPO4 solution, until pH of collagen solution become neutral or weak base, then it was frozen at -60 °C and allowed to thaw at room temperature. Collagen is separated from the remaining liquid by centrifugation at 1000 g for 10 min. The obtained collagen is dissolved with acetic acid to a concentration of 1%, then freeze-dried (EVD-12; Unicryo MCL-60). Obtained sponge was treated with 0.25% chitosan solution for 24 hours, then washed with distilled water on a vibrator, frequently changing the water. After that the collagen/chitosan sponge is freeze-dried and cross-linked at room temperature in a vapor chamber with 12.5% glutaraldehyde (SERVA) for 24 hours. Results. Pore size in native collagen sponge varies between 50 and 200μ, but in the case of hybrid collagen/chitosan sponge, pore size varies between 30 and 100μ. Conclusion. The obtaining method of a hybrid collagen/chitosan scaffold for cell seeding is effective. The sponge size and microscopic structure allow its utilisation in filling tissue defects and tissue engineering.