Abstract:
Introducere. Nivelul creatininei urinare este utilizat pentru a recalcula concentraţiile multor metaboliţi la estimarea vitezei de excreţie a lor cu urina, în cazurile în care colectarea urinei nictemerale este dificilă. Metoda Jaffe, bazată pe reacţia de reducere a anionului picrat în picramat cu creatinina şi utilizată pe scară largă, este simplă şi ieftină, dar nu-i suficient de selectivă faţă de alte substanţe reducătoare, care pot fi prezente în urină. La pacienţii cu alcaptonurie (AKU), acidul homogentisic (HGA), un metabolit anormal, este excretat cu urina în cantităţi destul de mari. În condiţiile metodei Jaffe, HGA nu interacţionează imediat cu acidul picric, dar se oxidează în mediu alcalin cu oxigenul atmosferic, formând produse de culoare închisă (Fig. 1), fapt ce duce la rezultate majorate considerabil pentru creatinină.
Scopul lucrării: Crearea unei variante a metodei Jaffe selective faţă de acidul homogentisic.
Materiale şi Metode.
Spectrofotometru UV-VIS "Lambda-25" (Perkin Elmer), probe de urină normală şi de la pacienţi cu alcaptonurie, substanţe de referinţă creatinină şi HGA, reagenţi (acid picric, hidroxid de sodiu).
Descrierea metodei elaborate:
Toate operaţiunile s-au efectuat la temperatura aerului 20°C T 1°C, adăugând probele şi reactivele la aceiaşi temperatură.
La 20 ml urină de analizat sau soluţie standard creatinină »1 mg/ml (8.84 mMol/l) se adaugă 1.6 ml apă, 0.4 ml soluţie acid picric 1% şi, în ultimul rând, 0.4 ml soluţie hidroxid de sodiu 0.75 Mol/l; se agită scurt. Exact după 3 minute de la adăugarea soluţiei hidroxid de sodiu se măsoară absorbanţa optică la lungimile de undă 520 şi 600 nm. Soluţie de compensare se foloseşte proba preparată din 20 ml apă în loc de urină. Concentraţia creatininei în urină (X, mMol/l) se calculează conform formulei: X = CSt • AU,520 - 2• 3 • AU,600/ ASt520 - 2• 3 • ASt,600 în care: CSt - concentraţia soluţiei standard creatinină, mMol/l; AU520 şi AU,600 - valori de absorbanţă optică a probei, preparate din urină, la 520 şi 600 nm corespunzător; ASt,520 şi ASt,600 - valori de absorbanţă optică a probei, preparate din soluţia standard creatinină, la aceleaşi lungimi de undă.
Rezultate. Pe bază analizei spectrelor UV-VIS ale probelor model (Fig. 2) s-au selectat 2 lungimi de undă pentru măsurare: 520 nm, utilizată şi în metoda Jaffe tradiţională datorită raportului optim dintre absorbanţa acidului picramic (produsul reducerii acidului picric cu creatinina) şi absobanţă de fon a reactivului, şi 600 nm - în afara benzii de absorbanţă a acidului picramic. Coeficientul 2.3 în formula de calcul este raportul dintre valorile absorbanţei produselor de oxidare a HGA în mediu alcalin la 520 şi 600 nm. Totodată s-a observat că, în prezenţa HGA, răspunsul analitic pentru creatinină scade în timp, probabil din cauza interacţiunii dintre acidul picramic şi produsele intermediare a oxidării HGA de natură chinonă. Din acest motiv reacţia trebuie de efectuat la temperatură constantă şi în timp limitat.
Metoda propusă a fost testată pe probe de urină de la pacienţii cu alcaptonurie (AKU 1, AKU 2, AKU 3, AKU 4) şi cu fenilcetonurie (urină fără HGA) (Control 1, Control 2, Control 3), comparând rezultatele cu cele obţinute prin metoda HPLC, utilizată ca metoda de referinţă (Tabelul 1). Metoda oferă rezultate veridice pentru creatinina urinară independent de prezenţa HGA.
Concluzii: A fost creată o variantă simplă şi fiabilă a metodei Jaffe, cu măsurarea la 2 lungimi de undă, utilă pentru determinarea creatininei urinare la pacienţii cu alcaptonurie.
